中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是成纤维细胞，在培养基中有血清的情况下贴壁生长，且很少分泌自身蛋白，通过驯化，可以悬浮培养于无血清，化学成分确定的培养基中，这有利于排除培养基中血清蛋白对后期产物纯化造成的困难。其生长良好，且与行业内现有的，用于生产药物蛋白的真核细胞系（酵母等）比较，产物蛋白糖基化程度更高，更加有利于提高药效，减少药物副作用，基于这一特点，人们开始利用基因工程技术对其进行改造，使其具有易于转入目的基因片段，并且可以对成功转入基因片段的细胞克隆，经过加药等条件被筛选出来的特性。

目前，行业内主要利用锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）4种基因组编辑技术来进行CHO 细胞系的基因改造工作。

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）基因改造后的细胞株筛选和评价：

一）如何确定其来源？

当我们得到某野生CHO 细胞系（例如：CHOK1，CHO-S为CHOK1悬浮驯化后的细胞株，CHO-AA8等）时，首先可进行基因的测序，与基因库中的原始序列做比对，之后确定细胞系的纯净和准确。

如果是经过基因改造的CHO 细胞系，可以用限制性内切酶图谱鉴定细胞系。保重细胞库的纯净和准确。

二）常用的生产用基因缺陷型CHO细胞株

行业内现在比较常用的，可直接用于药物研发的基因缺陷型CHO细胞系，大致为，GS（谷氨酰胺合成酶）基因缺陷CHO 细胞系，DHFR（二氢叶酸还原酶）基因缺陷CHO细胞系(例如：CHO-DUXB11,CHO-DG44)。

三）成功转染外源基因的细胞株如何评价？

我们将筛选标志，GS基因或DHFR基因与外源基因分别转染入GS（谷氨酰胺合成酶）基因缺陷CHO 细胞系，DHFR（二氢叶酸还原酶）基因缺陷CHO细胞系缺陷型细胞系，之后加入筛选压力（转染GS基因的用蛋氨酸亚氨基代砜MSX,DHFR基因的用氨甲喋呤MTX）使成功转染入目标蛋白基因的细胞克隆得以生存，之后通过SDS-PAGE,流式细胞术确定高表达，高亲和目标蛋白的克隆，之后对高表达克隆进行扩大培养和生产条件优化。

有研究人员曾经将抗凋亡基因（如）转染入CHO细胞系，来改善CHO细胞系生长状态延长细胞生长周期，减少代谢产物对细胞的影响，提高细胞分泌药物蛋白的能力。之后，对筛选出的几株成功转染抗凋亡基因的细胞进行比较筛选，通过流式细胞术，检测细胞凋亡情况，选择出抗凋亡能力最强的一株细胞，同时进行限制性内切酶图谱鉴定，确定其插入位点正确。

之后，将优选细胞株进行工艺条件优化，从接种开始记录细胞密度，活率。将以上实验结果与改造前的原始细胞株做对比，实验结果是，改造后的细胞株，细胞的抗凋亡能力增强，细胞可在2*10 ^7左右仍保持较高的活率，并且维持较长的平台期。

也有研究人员用改造的GS缺陷CHO细胞株与未经改造的CHO-S细胞株同时转染入含有筛选标记基因和药物蛋白基因的质粒后，将两种细胞系产生的分泌药物蛋白的子代细胞株进行工艺研究，发现相同培养基条件下，改造后的GS缺陷CHO细胞系筛选出的阳性株药物蛋白表达量集中在2-3g/L区间内，而未经改造的CHO-S细胞系筛选出的药物蛋白表达量集中在1-2g/L区间内。

且有可靠数据支持，经过筛选的稳定高表达药物蛋白的GS KO细胞株不会因为MSX压力的消失而明显降低表达量。而培养后期，营养物质的逐渐耗竭，是导致细胞生长不良的主要原因。

以上的研究表明，GS 缺陷CHO 细胞系，在工业生产过程中有明显优势，因为MSX作为细胞毒物在生产过程中一经添加很难去除。

随着CHO GS-KO 细胞系的应用越来越多，人们发现在此细胞系用于筛选高表达株的过程中，虽然其筛选出的阳性株比例增加，但是阳性株的蛋白表达的稳定性，随着传代次数增加，稳定性下降，分泌蛋白的能力（Qp单细胞每日蛋白分泌量pg/cell/day）也会降低。而对此，人们做出研究，在筛选CHO GS KO转染得到的工作细胞株时，选择凋亡时间越晚，凋亡蛋白分泌越少，而能转录翻译出药物蛋白的mRNA表达越高的细胞株，其稳定性也越好。

同时，细胞株确保单克隆也是保证细胞状态稳定的重要条件，有数据表明，通过流式细胞仪染色，表达量不同的两株细胞会在细胞数量第八次，第十五次倍增显示出两个明显分离的荧光强度峰。细胞株的不纯会导致分泌量少的细胞株在后期培养中与分泌量高的细胞株竞争营养，造成浪费。